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细胞冷冻保存常识
1.1.欲冷冻保存的细胞应在生长良好的指数生长期且高存活率,约为80-90%的汇合度。

1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如杂交瘤细胞应在冷冻保存前一至二日测
试是否有抗体之产生。
1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色。4℃避光保存,勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4.冷冻保存之细胞浓度: DMSO 的浓度介于 5%~20% 之间。生长培养液的体积应调整以适于所用细胞保护剂的变化。
1.4.1.正常人成纤维细胞:1-3×106 cells/ml
1.4.2.杂交瘤细胞:1-3x106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些杂交瘤细胞会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
1.4.3.贴壁的肿瘤细胞系:5-7x106cells/ml,依细胞种类而异。腺癌解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1-3×106cells/ml。
1.4.4.其他悬浮细胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
1.5.冷冻保护剂浓度为5%或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同
时,亦应作一个对照培养,以防止冷冻失败。+n6
2.细胞冷冻保存的具体操作
2.材料:
2.1.生长良好之培养细胞
2.2.新鲜培养基
2.3.DMSO(SigmaD-2650)
2.4.无菌塑料冷冻保存管
2.5.0.4% w/v台盼蓝
2.6.血球计数盘与盖玻片
2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)
3.步骤:
3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10%,
混合均匀,置于室温下待用。
3.3.依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约20ul)计数细胞浓
度及冻前存活率。
3.4.离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,对应细胞适合的冻存密度混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1ml/管,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
3.5.冷冻保存方法:在每一个冻存管上注明细胞系的名字,冻存者姓名和冻存时间,方便日后寻找。将一批细胞用橡皮筋捆绑住,用足够多的棉花将冻存管包裹,包括烧杯的底座和瓶顶,保护细胞逐级冷却,防止过快冷冻产生的冰晶破坏细胞状态,放入-80℃冷冻,然后放置于液氮中。


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上海传秋生物科技有限公司
Shanghai Chuan Qiu Biotechnology Co.,Ltd.
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