目前，长期保存细胞的方法是将细胞冷冻在液氮（-196℃) 中，液氮可以保存一年甚至几年。解冻后，大多数细胞仍能生长繁殖。为了适当起见，细胞应在冷冻一年后进行冷冻，然后再进行冷冻保存。冻结细胞时，应加入保护剂，否则，细胞内外的水会形成冰晶，从而对细胞造成机械损害。加入保护剂后，可降低冰点。在缓慢冻结的条件下，细胞内的水在冻结前渗出，以避免冰晶的破坏。目前，甘油和二甲基亚砜（DMSO) 对细胞无毒，分子量小，易于穿透细胞。甘油浓度为 10%≤20%，二甲基亚砜 5%≤15%，常用 10%。此外，还应在培养基中添加冷冻液，以提供营养、渗透压和 pH 值。细胞复苏是指冷冻细胞的再培养。快速解冻细胞，使其通过最脆弱的细胞在 -5℃。

实验材料对数生长期细胞

试剂，试剂盒消化液培养基，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 仪器、消耗品秸秆离心管冷冻管培养瓶标记笔纱小口袋温度计砂轮

实验步骤

I. 细胞的冷冻保存

1. 细胞悬液的制备

选择对数细胞，10 毫升培养瓶面，几乎单层可冷冻一管；24 小时前，液体变化，收集细胞；按传代法制作细胞悬液。

二。细胞收集

细胞悬液进入无菌离心管，每分钟 1000 转，离心 5 分钟，取血清。

3. 冷冻液体

将培养基和甘油按 9：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷冻保存液中，放入离心管中，轻轻吹入细胞悬液中。

4. 装瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的细胞悬液，并尽可能将其放入瓶中，使液体不接触瓶口。

5. 印章

把瓶子封在火焰最热的部位，例如用冷藏箱管把盖子拧紧。

6. 标记

标记单元格名，并在当月的那天将其冻结。

7. 冻结和保存

安全瓶放置在纱布袋中，4℃，2 小时，-20℃，2 小时。液氮气相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中。液氮量必须足以维持温度不变。

二。细胞复苏

1. 用大镊子取出瓶子，37°42℃放入水中，不时摇匀，使瓶子能迅速通过 -5°0℃。

2. 在超净台上，用砂轮擦拭瓶颈，用酒精棉球消毒，打开瓶，将细胞悬液吸入培养瓶，稀释 10×，放入二氧化碳孵化器，隔天用新鲜培养基代替冷冻保鲜剂。

目前，长期保存细胞的方法是将细胞冷冻在液氮（-196℃) 中，液氮可以保存一年甚至几年。解冻后，大多数细胞仍能生长繁殖。为了适当起见，细胞应在冷冻一年后进行冷冻，然后再进行冷冻保存。冻结细胞时，应加入保护剂，否则，细胞内外的水会形成冰晶，从而对细胞造成机械损害。加入保护剂后，可降低冰点。在缓慢冻结的条件下，细胞内的水在冻结前渗出，以避免冰晶的破坏。目前，甘油和二甲基亚砜（DMSO) 对细胞无毒，分子量小，易于穿透细胞。甘油浓度为 10%≤20%，二甲基亚砜 5%≤15%，常用 10%。此外，还应在培养基中添加冷冻液，以提供营养、渗透压和 pH 值。细胞复苏是指冷冻细胞的再培养。快速解冻细胞，使其通过最脆弱的细胞在 -5℃。

实验材料对数生长期细胞

试剂，试剂盒消化液培养基，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 仪器、消耗品秸秆离心管冷冻管培养瓶标记笔纱小口袋温度计砂轮

实验步骤

I. 细胞的冷冻保存

1. 细胞悬液的制备

选择对数细胞，10 毫升培养瓶面，几乎单层可冷冻一管；24 小时前，液体变化，收集细胞；按传代法制作细胞悬液。

二。细胞收集

细胞悬液进入无菌离心管，每分钟 1000 转，离心 5 分钟，取血清。

3. 冷冻液体

将培养基和甘油按 9：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷冻保存液中，放入离心管中，轻轻吹入细胞悬液中。

4. 装瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的细胞悬液，并尽可能将其放入瓶中，使液体不接触瓶口。

5. 印章

把瓶子封在火焰最热的部位，例如用冷藏箱管把盖子拧紧。

6. 标记

标记单元格名，并在当月的那天将其冻结。

7. 冻结和保存

安全瓶放置在纱布袋中，4℃，2 小时，-20℃，2 小时。液氮气相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中。液氮量必须足以维持温度不变。

二。细胞复苏

1. 用大镊子取出瓶子，37°42℃放入水中，不时摇匀，使瓶子能迅速通过 -5°0℃。

2. 在超净台上，用砂轮擦拭瓶颈，用酒精棉球消毒，打开瓶，将细胞悬液吸入培养瓶，稀释 10×，放入二氧化碳孵化器，隔天用新鲜培养基代替冷冻保鲜剂。

目前，长期保存细胞的方法是将细胞冷冻在液氮（-196℃) 中，液氮可以保存一年甚至几年。解冻后，大多数细胞仍能生长繁殖。为了适当起见，细胞应在冷冻一年后进行冷冻，然后再进行冷冻保存。冻结细胞时，应加入保护剂，否则，细胞内外的水会形成冰晶，从而对细胞造成机械损害。加入保护剂后，可降低冰点。在缓慢冻结的条件下，细胞内的水在冻结前渗出，以避免冰晶的破坏。目前，甘油和二甲基亚砜（DMSO) 对细胞无毒，分子量小，易于穿透细胞。甘油浓度为 10%≤20%，二甲基亚砜 5%≤15%，常用 10%。此外，还应在培养基中添加冷冻液，以提供营养、渗透压和 pH 值。细胞复苏是指冷冻细胞的再培养。快速解冻细胞，使其通过最脆弱的细胞在 -5℃。

实验材料对数生长期细胞

试剂，试剂盒消化液培养基，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 仪器、消耗品秸秆离心管冷冻管培养瓶标记笔纱小口袋温度计砂轮

实验步骤

I. 细胞的冷冻保存

1. 细胞悬液的制备

选择对数细胞，10 毫升培养瓶面，几乎单层可冷冻一管；24 小时前，液体变化，收集细胞；按传代法制作细胞悬液。

二。细胞收集

细胞悬液进入无菌离心管，每分钟 1000 转，离心 5 分钟，取血清。

3. 冷冻液体

将培养基和甘油按 9：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷冻保存液中，放入离心管中，轻轻吹入细胞悬液中。

4. 装瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的细胞悬液，并尽可能将其放入瓶中，使液体不接触瓶口。

5. 印章

把瓶子封在火焰最热的部位，例如用冷藏箱管把盖子拧紧。

6. 标记

标记单元格名，并在当月的那天将其冻结。

7. 冻结和保存

安全瓶放置在纱布袋中，4℃，2 小时，-20℃，2 小时。液氮气相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中。液氮量必须足以维持温度不变。

二。细胞复苏

1. 用大镊子取出瓶子，37°42℃放入水中，不时摇匀，使瓶子能迅速通过 -5°0℃。

2. 在超净台上，用砂轮擦拭瓶颈，用酒精棉球消毒，打开瓶，将细胞悬液吸入培养瓶，稀释 10×，放入二氧化碳孵化器，隔天用新鲜培养基代替冷冻保鲜剂。

目前，长期保存细胞的方法是将细胞冷冻在液氮（-196℃) 中，液氮可以保存一年甚至几年。解冻后，大多数细胞仍能生长繁殖。为了适当起见，细胞应在冷冻一年后进行冷冻，然后再进行冷冻保存。冻结细胞时，应加入保护剂，否则，细胞内外的水会形成冰晶，从而对细胞造成机械损害。加入保护剂后，可降低冰点。在缓慢冻结的条件下，细胞内的水在冻结前渗出，以避免冰晶的破坏。目前，甘油和二甲基亚砜（DMSO) 对细胞无毒，分子量小，易于穿透细胞。甘油浓度为 10%≤20%，二甲基亚砜 5%≤15%，常用 10%。此外，还应在培养基中添加冷冻液，以提供营养、渗透压和 pH 值。细胞复苏是指冷冻细胞的再培养。快速解冻细胞，使其通过最脆弱的细胞在 -5℃。

实验材料对数生长期细胞

试剂，试剂盒消化液培养基，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 仪器、消耗品秸秆离心管冷冻管培养瓶标记笔纱小口袋温度计砂轮

实验步骤

I. 细胞的冷冻保存

1. 细胞悬液的制备

选择对数细胞，10 毫升培养瓶面，几乎单层可冷冻一管；24 小时前，液体变化，收集细胞；按传代法制作细胞悬液。

二。细胞收集

细胞悬液进入无菌离心管，每分钟 1000 转，离心 5 分钟，取血清。

3. 冷冻液体

将培养基和甘油按 9：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷冻保存液中，放入离心管中，轻轻吹入细胞悬液中。

4. 装瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的细胞悬液，并尽可能将其放入瓶中，使液体不接触瓶口。

5. 印章

把瓶子封在火焰最热的部位，例如用冷藏箱管把盖子拧紧。

6. 标记

标记单元格名，并在当月的那天将其冻结。

7. 冻结和保存

安全瓶放置在纱布袋中，4℃，2 小时，-20℃，2 小时。液氮气相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中。液氮量必须足以维持温度不变。

二。细胞复苏

1. 用大镊子取出瓶子，37°42℃放入水中，不时摇匀，使瓶子能迅速通过 -5°0℃。

2. 在超净台上，用砂轮擦拭瓶颈，用酒精棉球消毒，打开瓶，将细胞悬液吸入培养瓶，稀释 10×，放入二氧化碳孵化器，隔天用新鲜培养基代替冷冻保鲜剂。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，

加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

其他细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，

而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-80℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。