细胞冻存注意事项

      细胞冻存

      方法:

      冻存液最好现配:按1 :3 :6(或1 :2: 7 )配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基

      (养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，

      对于贴壁细胞:

      1吸出旧培养液加PBS冲洗- -次

      2胰酶消化

      3加培养基中止消化,有的细胞是加血清中止

      4离心收集细胞,不同细胞离心率不一样(以上仅为贴壁细胞,悬浮细胞收集就用第四部)

      5吸出离心管上清液,加1ML的冻存液重悬细胞,移到冻存管,放4度半小时,-20度两小时, -80度过夜,再放液氮长期保存

      悬浮细胞:直接离心收集, PBS洗涤

注意事项:
Q错误的时机:
细胞状态不好(长的太过了,培养液已经很黄;细胞可疑污染;细胞已经开始凋亡或崩解;
连续培养超过二个月,细胞性状已有改变改变)。

解决:
最佳时机:细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。
Q细胞太少:
冻存时细胞浓度低于1-5x 1000,000/ml。( 复苏很难成功)。
解决:
离心后调整细胞浓度。( 不要重新洗细胞)。
Q盖子不紧:
冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。
解决:
选择原配的管子和盖子(不同牌子/型号的颜色会有差别)。

Q单薄的冻存盒:

放在-80度的冻存盒,壁太薄,细胞在被迅速降温。

解决:
选择厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量干棉花。( 冻存的原则:缓降! )

Q -80度太久:
放在-80度冰箱的时间超过半年。(冰箱的温度难以恒定:开门/关门,电压不稳等)
解决:

尽快转入液氮。

      1.液氮不足:

      液面不能漫过所有细胞。

      解决:

      定期测量液氮储备,保证细胞全部浸在液面下。

      1.取错细胞:

      找不到/拿错冻存管。

      解决:

      每支冻存管都标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。

      二、细胞复苏:

      方法:

      1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37°C温水中,并不时摇动令其尽快融化。

      2.从37°C水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;

      3.离心，1000rpm , 5min ;

4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶，37°C培养箱静置培养;

4. 5.次日更换一次培养液,继续培养。

      注意事项:

Q取错细胞:

      拿错冻存管。( 快快快,匆忙之中,难免出错,况且-170多度,冻手! )

      解决:

      ( 1 )核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

      (2)拿纸胞时戴手套!

Q水浴时间太长:
      2min还没融化。( 冻存管的壁较厚,隔热)

      解决:

      ( 1 )适当提高水浴温度(37度-40度)。

      (2 )要是冬天,就选用保温盒。

Q冰盒内时间太长:
      复苏1h后，还没有加入新的培养液。( 高浓度DMSO防止胞内形成冰晶,冻存时保护细

      胞,但复苏融解后,浸泡时间太久会,对红胞有毒性)

      解决:提前预定超净台, 减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

Q.失去耐心:
复苏三四天后,细胞没有任何动静,认为失败,倒掉所有细胞。( 有些细胞复苏后一两个星期才有起色)
解决:不要换液,耐心等待,两周后再做决定。