目标

本实验方案由欧洲认证细胞培养物典藏中心（ECACC，英国公共卫生部的组成部分）推荐用于其细胞系的冷冻保存。本实验方案采用被动方法，包括-80°C电动冰柜，用于细胞冻存液冷冻保存细胞培养物。ECACC通常使用来自Planer Products公司的可编程速率可控冰柜（Planer系列二）。这是冷冻细胞的一种最可靠、最可再现的方法，但由于此类设备的成本超出了大多数研究实验室所能承受的范围，因此下文将详细描述其他一些方法。如果需要定期冷冻大量细胞培养物，则建议使用可编程速率可控冰柜。

 材料

· 细胞冻存液（通常为70％基础培养基，20％ FBS，10％ DMSO）

· 70％乙醇水溶液

· PBS，不含Ca²⁺ / Mg²⁺

· 0.25%胰蛋白酶 / EDTA，溶于HBSS中，不含Ca²⁺/Mg²⁺

· DMSO

· 胰蛋白酶 / EDTA

· HL60

 设备

· 个人防护装备（无菌手套、实验室工作服）

· 全脸保护面罩 / 护目镜

· 设置为37°C的水浴

· 适当密封水平的微生物安全柜

· 离心机

· 血细胞计数器

· 预先贴好标签的安瓿瓶 / 冷冻管

· 细胞冷冻装置

 操作步骤

使用倒置显微镜观察培养物，以评估细胞密集程度，并确认不存在细菌和真菌污染物。

用上述胰蛋白酶 / EDTA使贴壁和半贴壁细胞悬浮，并将其重悬于至少相当于胰蛋白酶体积的一定体积的新鲜培养基中。悬浮细胞系可以直接使用。取出一小部分细胞（100-200 μL）并进行细胞计数。理想情况下，细胞活力应该超过90％才在冷冻后达到良好恢复。将剩余的培养物以150 g离心5分钟。

在细胞冻存液中以每毫升2-4×10⁶个细胞的浓度重悬细胞。将1 ml 细胞等分移液到贴有标签的冷冻安瓿瓶中，标签须注明细胞系名称、传代数、细胞浓度和日期。将安瓿瓶放入被动式冰柜内，例如Nalgene Mr. Frosty。用异丙醇填充冰柜，并设置为-80℃过夜。冷冻后的安瓿瓶应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。

 重点

最常用的冷冻保护剂是二甲基亚砜，然而，它并不适用于所有细胞系，例如，HL60（产品编号：98070106-1v1-ECACC），其中的DMSO用于诱导分化。在这种情况下，应使用甘油等替代品。上面推荐的ECACC细胞冻存液已被证明是适合大多数细胞类型的良好的通用培养基。另一种常用的细胞冻存液配方是70％基础培养基，20％ FBS，10％ DMSO，但这可能不适用于所有细胞类型。在定期使用之前，检查它是否适用于您的细胞。至关重要的是，培养物必须是健康的，并处于生长的对数阶段。用预先汇合的培养物（低于其最大细胞密度的培养物），在冷冻之前24小时更换培养基，即可实现这种条件。

冷却速率可以改变，但一般原则是，每分钟降低1℃至3℃被证明适合于大多数细胞培养物。

Mr. Frosty系统的替代方案是Taylor Wharton被动式冰柜，细胞冻存液这该系统中，安瓿瓶保存在杜瓦瓶颈的液氮蒸气中。该系统使安瓿瓶逐渐降低，温度随之而降低。也有降温速率可控的冰柜，如果会定期冷冻大量安瓿瓶，这类冰柜特别有用。作为最后的手段，如果没有任何其他设备可用，可以将安瓿瓶放置在隔热良好的盒子内（例如壁厚至少1 cm的聚苯乙烯盒子），并置于-80℃下过夜。重要的是必须确保盒子在整个冷冻过程中保持直立。冷冻后的安瓿瓶应转移到液氮储存容器的气相中并记录位置。

如果使用涉及-80°C冰柜的冷冻方法，则必须使用分配给细胞系冷冻的区域，这样可避免样品被无意中拿出。如果这发生在冷冻的关键阶段，细胞活力就会受到影响。

 解决问题的建议

John Ryan博士
Corning Incorporated, Life Sciences
Acton, MA 01720

在解冻和接种培养物后，通常很快就注意到与冷冻储存相关的存活率问题。容易出问题四个主要方面有：

1. 在收获和处理细胞期间。细胞过度暴露于解离剂，使用有毒的冷冻保护剂，或使高密度细胞悬液被长时间置于室温下或在过于碱性的pH下，都可能造成问题。

2. 在冷却（冷冻）过程中。细胞过度损伤和培养物活力降低，通常是由于使用过快或过慢的冷却速率，或者由于冷却过程暂时中断。不使用合适浓度的合适冷冻保护剂也会导致活力问题。

3. 冷冻储存期间。如果小管在移入冰柜的过程中受热，或者冰柜温度没有始终保持在适当的低温温度下，则通常会降低培养物活力。

4. 在解冻和恢复期间。如果解冻过程太慢或冷冻保护剂被不适当地除去，就会造成问题。

这些活力问题通常可以借助以下技术发现冷冻过程中造成问题的环节，然后加以纠正。收获足够的细胞，至少制备四小管。然后取出一个细胞悬液样品，其细胞数量等于将放入小管的细胞数，立即将其置于含有适量培养基的培养容器中并孵育。该培养物将用作对照，以与其余步骤中建立的培养物进行比较。

接下来，将冷冻保护剂添加到剩余的细胞中，并等分至三个小管中。将一个小管置于4°C下1小时。然后从小管中取出细胞，好像它们刚刚从冰柜中解冻一样，然后如上所述接种在培养基中。将该培养物与对照培养物进行比较，以确定是否存在与冷冻保护剂相关的任何问题。

同时，像往常一样通过缓慢冷却过程处理其余的小管。然后如上所述立即将一个小管瓶解冻并处理。将该培养物与对照培养物进行比较，以确定是否存在与缓慢冷却过程相关的任何问题。

然后将其余小管转移到低温冰柜中储存过夜，然后如上所述进行解冻和处理。将该培养物与对照培养物进行比较，以确定是否存在与低温储存条件相关的任何问题。如果有额外的细胞小管可用，应使用几种不同的恢复技术来确定恢复技术是否是问题根源。

通过将所有培养物与原始培养物进行比较，应该可以确定问题发生在冷冻过程的哪个阶段。知道后，细胞冻存液本指南及其参考文献中提供的信息应足以消除问题。