悬浮细胞

材料：

对于细胞冻存

对数晚期的75 cm2 T型细胞瓶（约40 mL / T瓶）

细胞冻存液（通常含有10％二甲基亚砜，DMSO）

标记的低温小瓶（对数晚期每40 mL体积的细胞约5个）

对于解冻

冷组织培养基

25平方厘米的T型烧瓶

细胞冻存程序：

预冻存

1）在显微镜下检查细菌，酵母或真菌污染。

2）测试支原体样品。

3）当细胞达到对数晚期时，使用Coulter计数器确定细胞密度。计算烧瓶中的细胞总数，并确定所需的细胞冻存液的量。 （细胞应重悬于5,000,000至20,000,000细胞/ mL的冷冻培养基中。）

冻结

4）将细胞在50mL Falcon管中以1000g离心15分钟。

5）当细胞旋转时，制备细胞冻存液（例如，90％FBS，10％DMSO）。标记低温小瓶，包括日期，细胞类型和用户首字母。

6）从离心细胞中吸走上清液并加入细胞冻存液。研磨细胞直至均匀。

7）每个低温小瓶快速分装1 mL细胞冻存液。拧紧每个小瓶。

8）将小瓶放入储存盒并将用纸巾绝缘的盒子放入Tupperware®容器中。将整个容器放入-20°C冰箱。

9）3小时后，将容器转移至-80℃冰箱并储存过夜。

10）第二天，将细胞放入液氮罐中的适当架子中。

后冻结

11）从液氮罐中取出一个小瓶，并按照下面的解冻复苏程序测试冻存是否成功。

复苏程序：

1）从液氮罐中慢慢取出适当的托盘架。取下长安全销，从适当的托盘中取出一个小瓶。

2）将托盘放回插槽中，然后将安全销放回原位。将托盘架再次送回液氮罐和盖罐。

3）在37°C水浴中快速解冻小瓶，直到只剩下一小块冰粒。用乙醇喷洒小瓶，擦拭，并放入罩中。

4）将小瓶（~1mL）的内容物吸移到T25烧瓶中。

5）缓慢加入4mL冷培养基，每10秒钟以约1滴的速度加入，偶尔旋转。再加入5mL培养基。

6）将烧瓶放入适当的培养箱中。

7）由于细胞冻存液含有二甲基亚砜（DMSO），6-12小时后将细胞分解并重悬于新T25培养瓶中的新鲜预热培养基中。