大鼠脂肪干细胞原代培养几次都没有细胞长出？

Q:我最近刚入手大鼠脂肪干细胞的原代培养，按照文献步骤操作的，可是养了几次都没有细胞长出，我不知道哪一点有问题！

另外，文献上都说取大鼠腹股沟皮下脂肪组织，为什么我解剖大鼠时找不到腹股沟皮下脂肪组织啊，

是因为我地方弄错了，还是别的原因。不甚感激！我用的0.1%I型胶原酶，37°C震荡消化60min，80-120 rpm / min，含10%FBS的低糖DMEM。
另外，I型胶原酶消化完，用等体积培养液终止消化离心后（1200rpm/min，10min），沉淀很少，感觉大部分脂肪都在顶层，这是什么原因，怎么解决这些问题！

A:我觉得这里有几个关键的问题要注意一下：

1.你用的大鼠是多大体重的？如果大鼠年龄太老，细胞的活性就不好，建议用80-100g的大鼠试试；

2.腹股沟皮下脂肪组织还是很多的，位置在大腿内侧与腹部交汇处，不知道你是否取的是这个位置的；

3.0.1%I型胶原酶，37°C震荡消化60min是可以的，不知道你是用什么容器装的？15ml离心管？如果是15ml离心管的话，因为脂肪是漂在上面的，所以扩大接触面积才能消化到更多的细胞，建议你换更大接触面的容器试试。另外，取下的脂肪组织应尽可能剪碎，原因和前面相同；

4. 80-120 rpm / min？是不是写错了？应该是800-1200 rpm / min，这个转速时可以的；

5. I型胶原酶消化完，下面的沉淀里就有你要的细胞，你既然能够看得到沉淀，说明还是有细胞的，大部分的脂肪因为密度低肯定会漂在顶层；

6.另外，无菌原则要注意做到位，这很重要，要准备至少两套手术器械，一套取材用，一套剪碎脂肪组织用，取材时，剪开皮肤的剪刀和夹皮肤用的镊子等，不能用来夹和剪皮下的脂肪，避免污染；

7.首次换液的时候，尽量避免用力晃动瓶子，而且首次换液建议不用PBS漂洗，吸取原培养基后，直接加新培养基。

最后祝实验顺利！