细胞冻存液的配方是什么

细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！
一 材料：

生长良好之培养细胞 ，新鲜培养基，  DMSO ，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片 。

二步骤：

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形,最好细胞应该处于对数生长期。
2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 
2.3. 依细胞传代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度。 

2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.5 接着置于-20℃冰箱，约30-60min。

2.6. 置于-80超低温冰箱中放置过夜。

2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

三 注意事项：

3.1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。

在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存，提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。

冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定，但是好多人认为胎牛血清含量越高越好！

常用的细胞冻存液配方为：

    20％血清（FBS）、10％DMSO、70％培养基；

    或90％血清（FBS）、10％DMSO，更可防止细胞内冰晶形成。

3.2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。 

可以先在泡沫上打孔，把冻存管塞进去。这样降温可以慢一点，当然包上棉花也是不错的主意

3.3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

3.4  -20°C 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡。

3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml 以上，冻存细胞健康程度 一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存
3.6 细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积，原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存，这实际上并不好。

原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，液体容易流到管口，很容易在后续的操作中造成污染。

建议0.5-1ml之间即可。但是还是用1.5ml的话，具体操作时，冻存管直立起来放在-20的冰箱里，这样不容易造成污染。
同时冻存细胞的时候，一定加上封口膜，这样可以避免复苏的时候，水浴箱里的水进入盖子的缝隙中！

冻存管外面用封口膜封上后，最好再用白胶布再封一下。

这样可以防止细胞复苏时，封口膜崩裂，水浴箱中的水进入冻存管。

3.7 提醒;不要将细胞冻存在-4度，或－20时就忘了，很心疼。

小秋建议使用HAKATA无血清细胞冻存液，无需程序降温，直冻-80°C冰箱，可长期保存达5年。   

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