细胞冻存简介

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于 -196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

为什么要进行细胞冻存

连续培养的细胞系容易发生遗传漂变，有限细胞系最终会发生衰老，所有培养的细胞都易受到微生物污染，即使运转情况最好的实验室也会遇到设备故障的问题。由于已建立的细胞系是一种宝贵资源，更换细胞系成本高昂，而且耗费时间，因此，十分有必要将细胞冷冻起来长期保存。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

培养细胞冻存方案

以下实验方案介绍了培养细胞冻存的一般流程。详细的实验方案，必须参阅针对具体细胞的产品说明书。

实验前准备

用具紫外照射消毒（30min）：无菌培养瓶，15ml 离心管，移液管，移液枪，枪头。采用通风机通风 3min。以 75% 酒精擦拭操作台和双手，准备好冰盒，离心机调节至 800rpm，5min。
配制细胞冻存液：冻存液应该提前配置，于 2℃至 8℃下储存，直至使用。冻存液常规通常配比为基础培养基：血清：DMSO=7:2:1。加大冻存液中血清量有利于某些脆弱的肝细胞或珍贵的细胞的保存，可调整为血清：DMSO=9:1。

胰蛋白酶 /EDTA 消化

从培养箱中取出待传代的细胞（将盖子拧紧），75% 酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基，PBS 缓冲液洗去残留的旧培养基，加入消化液，放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入细胞完全培养基中止消化，消化时间为 1-5min，具体以细胞而异，采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，取所有的细胞悬液放入干净的 15ml 离心管内，每分钟 1000rpm，5min。

细胞冻存

取出冻存管，注明细胞名称，代数，日期。离心后，以无菌吸管吸弃上清，不要吸到底部的细胞沉淀。将细胞沉淀与冻存液充分混匀，根据计数结果，将细胞总数调节成细胞数量为 5-10*10⁵/ml 为宜。将细胞冻存悬液分装进细胞冻存管中，一般 2ml 的冻存管中装入 1-1.5ml 冻存液为宜。严密封口后，使用可控制降温速度的冷冻装置冷冻细胞，使温度每分钟大约降低 1℃。或者，将装有细胞的冻存管放入异丙的醇冻存盒中，然后将冻存盒置于 –80℃条件下过夜。若无冻存盒及其他冻存装置，可以先将冻存管置于 4℃ 30min，再 -20℃冻存 1h 直至完全冷冻，再转移至 -80℃冰箱过夜。第二天将已经冷冻的细胞转移到液氮容器中，置于液氮上方的气相空间中储存。

注意事项

冻存细胞系以备将来之用时，必须遵守以下原则。我们建议您严格遵守您所用细胞系附带的操作说明，以便获得最佳结果。
• 在细胞处于生长期密度达到 70-90% 的情况下进行培养细胞的冻存，并且细胞传代尽可能靠前。确保冻存前活细胞百分比至少为 90%。请注意最佳冻存条件取决于所用细胞系。
• 细胞应缓慢冷冻，可使用可控制降温速度的低温冰箱或者低温冷冻容器，使温度每分钟大约降低 1°C。
• 必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有 DMSO 或者甘油等冷冻保护剂。冷冻保护剂可降低培养基的冰点，并可减缓冷却速度，大大降低冰晶形成的危险 (冰晶可损伤细胞，导致细胞死亡)。注：DMSO 可促进有机分子进入组织。操作含 DMSO 的试剂时，应采用与此类物质安全危害相适应的设备和操作规范，并应按照当地法规处置此类试剂。建议可使用厂商生产的无血清细胞冻存液，使用方便，复苏率高。
• 注意冷冻保护剂 DMSO 的品质：DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色，以 5-10ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
• 将冷冻的细胞于–70℃以下温度储存；温度高于–50℃时，冷冻的细胞将开始变质。
• 必须使用无菌冻存管储存冷冻的细胞。装有冷冻细胞的冻存管可浸于液氮或者在液氮上方的气相空间内保存。生物危害性物质必须储存在液氮上方的气相空间内。将密封的冻存管置于气相空间储存可避免冻存管发生爆炸。如果使用液氮进行储存，必须注意玻璃和塑料冻存管有发生爆炸的危险，应佩戴面罩或护目镜。
• 所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内进行。
• 实行细胞慢冻的原则：缓慢冻存，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。而复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。