细胞传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，且也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。因此，细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。

细胞传代作为一种常规的实验操作，不但可以扩大细胞培养的数量，同时也可以避免细胞因进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。所以为了让细胞保持在对数生长期，维持细胞旺盛的分裂能力，这时候就需要进行细胞传代。

细胞传代要在严格的无菌条件下进行，并且根据不同细胞采取不同的方法：

☑ 贴壁生长的细胞用消化法传代；

☑ 部分贴壁生长但贴壁不牢固的细胞可以采用直接吹打传代；

☑ 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打传代。

上次讲了细胞复苏操作，今天来讲讲细胞传代的操作（适用于贴壁细胞的传代培养）！

细胞复苏流程图

细胞传代流程图

01

细胞传代前准备

➡ 实验开始前，将15mL离心管、移液管、枪头等实验需要用到的耗材放入无菌超净工作台，紫外线照射30min。

➡ 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

➡ 倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%汇合度即可进行传代。

02

胰蛋白酶/EDTA消化

➡ 弃去旧培养基，PBS洗去残留的旧培养基，重复洗两次。

注意：

贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。这一步的目的是为了去掉残余的培养基，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。

➡ 弃去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面（消化时间视具体细胞而定）。

➡ 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。立即加入2倍胰酶量的完全培养基轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

➡ 使用吸管或移液管轻轻吹打细胞表面，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。

注意：

吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，否则可能损伤和损失细胞。

➡ 取所有细胞悬液放入无菌15mL离心管内，250×g，室温离心4min。

03

细胞培养

➡ 离心后去除上清。加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀，计数。将细胞按(2.5~4)×104个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。

➡ 摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。

➡ 传代次日，观察细胞状态。若发现较多漂浮细胞，应予以换液。

➡ 待细胞生长至80%~90%汇合度，即需传代或冻存。

注意事项

胰酶浓度

推荐胰酶使用浓度为0.25%-0.04%EDTA，使用之前需预热至37℃且pH值应维持在7.2左右。切忌消化过度（包括胰酶浓度过高、消化时间过长等），否则会导致细胞死亡、分化、状态变差，分化能力丢失等现象。细胞消化过程中需要在显微镜下观察细胞的消化程度，当看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱落，此时应立即终止消化；若细胞仍有大部分贴壁，可适当延长消化时间以避免消化不彻底的情况出现。

细胞的差异

不同种类的干细胞差异很大，特别是与肿瘤细胞株的差异更大，很多经验不可以直接使用，消化时需要仔细摸索最佳的时间。

接种密度

干细胞传代过程中接种密度至关重要，如果太低会导致细胞增殖缓慢，甚至导致细胞老化，而细胞的老化是不可逆转的。一般细胞接种密度为20000个活细胞/cm2即5×105个活细胞/T25，不同的干细胞接种密度会稍有差异，比如hMSC，我们推荐的传代接种比例为1:2。

吹打细胞动作要轻柔

吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，否则可能损伤和损失细胞。