牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,常用于动物细胞的体外培养,具有极为重要的功能。
1.提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物。
2. 提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力。
3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用。
4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5.起酸碱度缓冲液作用。
6.提供蛋白酶抑制剂,使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。
胎牛血清都有哪些重要的指标
一、内毒素
内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有成分。当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时,才表现其毒性。内毒素直接参与细胞凋亡,血清中内毒素含量越低,对细胞毒性越小,越利于细胞的生长和传代;内毒素含量过高,会直接导致细胞提前老化。国际上规定,胎牛血清的级别,应以内毒素水平的高低来确定,其中,特级胎牛血清的内毒素应<10EU/ml
二、血红蛋白含量
胎牛血清的颜色会根据血红蛋白含量的不同表现出黄色、淡黄色、橘红色、微红色等。细胞培养用血清的标准是血红蛋白含量不高于20mg/dl,颜色越红,数值越高;反之,数值越低。实际上,血红蛋白含量的高低对血清并无直接影响。这个指标的意义在于能体现出采血过程的严谨规范程度,良好的操作能降低血清的溶血。
三、总蛋白含量
胎牛血清的总蛋白含量一般范围是30-40mg/ml,数值偏高,说明采血的牛龄偏大,不是胎牛;数值偏低,表明血清可能掺水了。
四、pH值
根据药典,胎牛血清的pH值在7.0-8.0之间,并没有什么具体依据把进口血清和国产血清用7.5这个分界线界定。
五、渗透压
胎牛血清渗透压的检测一般采用冰点法,渗透压摩尔浓度(mOsmol/kg):280-360之间
六、微生物
包括细菌、霉菌、支原体、噬菌体等。随着各个品牌血清生产条件的改善提高,细菌、霉菌等“大型”微生物几乎能100%控制。支原体通过0.1um3次无菌过滤去除。如CellMax胎牛血清,3次0.1um无菌过滤以后,又通过培养法和DNA染色法进行支原体检测,结果均呈现阴性才会放行销售。关于噬菌体主要是生产环境过程中带入,又无法过滤,很难彻底清除,但对血清质量影响不大,不过对于工业生产的客户来说,往往会采用γ照射的胎牛血清来避免噬菌体。
七、免疫球蛋白
免疫球蛋白的数值能完全体现出采血时的牛龄情况,新生牛血清容易产生IgM,IgG的含量也偏高;胎牛血清不含IgM,IgG的含量也较低。可以通过血清蛋白电泳SDS检测。
低IgG的胎牛血清推荐适用于抗体生产及相关领域。
有下列情况者,对血清内毒素应格外留意筛选:
1.养干细胞时,干细胞对内毒素非常敏感,如果血清中内毒素≥3EU/ml时,干细胞很容易死亡。很多使用者,在血清在试用前,就通过提早审核该批次《检测报告》,以决定是否入围进行试用。
2.养免疫细胞时,过高的内毒素可诱导免疫细胞释放炎症因子,抑制小鼠红细胞集落的形成等。
3.基因敲除相关的细胞实验,培养的细胞要尽可能保持其原始状态,任何引导细胞衰老或凋亡的试剂,都会让后续的实验结果“失之毫厘,谬以千里”。在准备血清和其他试剂时,选择极低的内毒素(最好≤1EU/ml),对实验至关重要;
4.原代培养、杂交瘤融合、细胞转染,或者肝细胞、神经细胞、内皮等难养细胞的扩增,这些都需要挑选好的血清给细胞以有力支持。因此,挑选更低的内毒素,是保证实验顺利的第一步。
5.实验室有些细胞,需要长期培养、长期冻存,或者经常复苏、经常培养的,血清会经常或长时间作用于细胞。为保证细胞的健康,都应该选用更低内毒素的血清,以避免内毒素长久对细胞的毒性影响。
总之,血清中内毒素含量过高,更容易导致细胞“亚健康”,造成数据不准,或细胞状态不良、老化、甚至死亡,导致试验中断失败。血清中的内毒素越低越好。
全球细胞培养学会均依据内毒素对血清的品质进行分级和命名。
内毒素含量越低的血清,级别就越高,以胎牛血清为例:
当血清中内毒素含量≤10EU/ml时,此血清为特级胎牛血清;
当血清中内毒素含量﹥10EU/ml,≤ 25EU/ml时,此血清为优级胎牛血清;
当血清中内毒素含量≥ 25EU/ml时,此血清为标准级胎牛血清;
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