干细胞冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环，但是干细胞不同于普通细胞系，其增殖扩增过程中需要聚团生长，为保持其细胞活性，不建议单细胞传代。而且使用血清+DMSO冻存方法，不能很好的保持细胞活性，且复苏细胞成活率较低。这次就重点介绍干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。

　　本方法适用于HAKATA™ 人间充质干细胞无血清培养基以及HAKATA™ 无血清细胞冻存液培养的细胞（同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞），冻存以及复苏前后，应当使用同一种培养基，复苏传代后可以更换其他培养体系。

HAKATA™ 无血清细胞冻存液是传秋生物独家研制的的一款化学成分确定，无血清，无动物源成分，且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下：

1、冻存：以下操作方法以6孔板为例：

　　注意：如果使用mFreSR™，请将所需量的mFreSR™融化并置于冰上。

　　（1） HAKATA™ 无血清细胞冻存液为即拿即用，且4℃保存，冻存液拿出后应快速放回4℃；

　　（2）使用干细胞消化液消化细胞；

（3）收集细胞，室温300×g离心5分钟；

　　（3）小心吸掉上清液，不要干扰细胞团；

　　（4）用1ml冻存液重悬细胞，并均匀分装到冻存管中

　　采用非程序降温法，将冻存管直接放入-80℃冰箱中，冻存24h后转移至液氮中长期保存。　　

　　2、解冻

　　预先包被细胞培养板，人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

　　（1）干细胞培养基室温平衡15-30min,不能37℃加热; 　　

（2）在水浴锅中持续晃动冻存管，37℃水浴锅中快速解冻细胞，直至细胞完全融化；　

（3）取出冻存管，用70％乙醇擦拭冻存管表面；

　　（4）准备15ml离心管，预先加入5mL干细胞培养基，将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中，尽量保持细胞聚团状态。

　　（5）在室温300×g离心5分钟。

　　（6）吸掉上清，注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞3-5次，不要破坏细胞聚团状态。

　　（7）分别取0.5mL细胞悬液，均匀接种到包被好的6孔板的2个孔中，并分别补充多能干细胞培养基至2m。

　　（8）置于37°C细胞培养箱中。在前后左右呈十字形摇动培养板板5次，以均匀分散细胞。

　　（9）每天更换培养基，并显微镜下观察细胞状。