小鼠总免疫球蛋白G(IgG）定量

分析酶联免疫检测试剂盒

使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 本试剂盒仅供科研使用。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。

1.IgG简介

免疫球蛋白G（IgG）主要由脾、淋巴结中的浆细胞合成和分泌，以单体形式存在。在个体发育过程中机体在出生后第3个月开始合成IgG，3～5岁接近成年人水平。IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清总Ig的75%。

免疫球蛋白G在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用，是机体抗感染的主要物质。

IgG是四链单体，根据IgG分子中γ链抗原性差异，人IgG有4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4（小鼠4个亚类是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）。不同IgG亚类的生物学活性有所差异。IgG的半衰期相对较长，约为20～30天。

2.检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠来源样本中的总IgG浓度。IgG捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IgG会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入与HRP耦连的抗IgG抗体后，抗小鼠IgG抗体与IgG接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IgG将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IgG浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IgG浓度。

3.试剂盒组成

3.1、预包被板12条/6条(96T/48T)；

3.2、标准品2瓶/1瓶(96T/48T)，冻干；  

3.3、20×标准品稀释液，1瓶10ml/5ml(96T/48T)；

标准曲线中0浓度标准品以标准品稀释液直接加入。

3.4、即用型抗IgG抗体的HRP酶结合物1瓶， 5ml/2.5ml（96T/48T）

3.5、TMB底物溶液，1瓶10ml/5ml（96T/48T）；

3.6、中止液，1瓶5ml；

3.7、浓缩洗涤液（20×），1瓶30ml/15ml（96T/48T）；

3.8、封板纸3张/2张（96T/48T）；

3.9、说明书一份；

4.检测中需要但没有提供而需要自备的材料：

4.1、振荡混匀器。

4.2、可控温水浴箱  37℃。

4.3、ELISA酶标仪（450nm）。

4.4、移液枪头等         

5．注意事项

5.1、未开封的试剂应保存在2－8℃。

包装箔袋开封后，应立即封紧。开封后的包被微孔板储存在2－8℃下可以稳定6个星期。

5.2、所有试剂和所需的微孔板条在使用前应平衡至室温。

5.3、使用前将浓缩洗涤液用蒸馏水按1：20稀释（例如：10ml浓缩洗涤液应用蒸馏水稀释至终体积200ml）。

5.4、稀释后的洗涤液在2－8℃下可以保存4个星期。

5.5、样本收集

血清和EDTA处理的血浆样本。避免使用明显溶血、黄疸、脂血样本。使用的血清和EDTA血浆样本，按常规方法制备。样品在2－8℃下保存不超过24小时。如果样品需要长期存放（3个月以上），应冻存在－20℃。使用过程中应避免反复冻融。

6.检测过程

所有的试剂和样本在使用前应平衡至室温并摇匀（摇匀过程应保证无泡沫产生）。一旦检测开始，应连续操作，不中断。开始分析前，推荐准备好所有试剂，打开瓶盖，将所需微孔板条固定等等，以防止实验中出现不必要的时间拖延。使用每种试剂、标准品或样品时，都应更换一次性移液枪头，以免交叉污染。

7.检测步骤

7.1、将所需微孔板条在微孔架上固定，按1份标准品稀释液加19份超纯水或去离子水提前稀释成标准品稀释液的工作原理；

7.2、移取10μl稀释好的标准品以及样本至相应微孔中，样本需稀释100000倍以上。

提前稀释标准品:加入标准品稀释液100μl至冻干标准品瓶中使IgG终浓度达到100ng/ml，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为100ng/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

7.3、 每孔加90μl标准品稀释液，25～28℃孵育120分钟；

7.4、 用洗涤液将微孔洗涤5次（推荐使用洗板机）。

重要提示：

洗涤液加入板孔中，需浸泡10秒，最后一次必须在干净的吸水纸上用力拍打微孔，除去残留洗涤液。洗涤操作的正确与否将影响整个实验分析的灵敏度和精密度。

7.5、每孔加50μlHRP耦连的抗IgG抗体，，25～28℃孵育60分钟；

7.6、用洗涤液将微孔洗涤5次（推荐使用洗板机）。

7.7、每孔加入100ul底物溶液。室温避光孵育15分钟（25－28℃）。

7.8、每孔加入50ul终止液，终止酶反应。并在450nm处测定OD值（参考波长600－650nm）。读取OD值最好在10分钟内完成。

8．结果计算

在方格座标纸上，以标准品的浓度作为横坐标（对数刻度），对应的OD值作为纵坐标（线性刻度）。利用连接的标准曲线可读出样本的OD值对应的浓度值。试剂浓度需乘以稀释倍数。

任何样品浓度如果高于最高标准品浓度，样品应用标准品稀释液作适当稀释后重新测量分析。所得结果乘以稀释倍数后即样品实际浓度。

9.参考数据及曲线

                  典型参考数据

小鼠IgG参考标准曲线

10．灵敏度、特异性和重复性

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为1.24ng/ml。

2.特异性：本试剂盒采用特异性抗体识别小鼠IgG，包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，检测值为总的IgG浓度。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.