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大鼠白细胞介素4ELISA试剂盒Rat IL-4 ELISA KIT
货号:HR-03
价格:¥2800.00/1760.00.00
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大鼠白细胞介素4定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测大鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-4浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系我们。

 

IL-4简介:

白介素4(IL-4)是一种多功能细胞因子,主要是由激活的T淋巴细胞、肥大细胞与骨髓基质细胞表达。IL-4因为糖基化的不同,分子量从15到19kDa不等。

IL-4可以对多种细胞起到调节免疫反应功能的作用。白细胞介素4参与多种B-细胞等此类细胞的激活过程,是DNA合成的协同刺激分子,它能诱导静息B细胞上II 型MHC (主要组织相容复合体)分子的表达。能增强IgE与 IgG1的分泌以及在细胞表面的表达,还可以调节淋巴细胞和单核细胞上对IgE低亲和Fc受体的表达。IL-4在抗体亚型转换中也起到重要的调节作用,是T辅助前体细胞向Th2细胞分化的重要调节因子,从而间接调节体液免疫以及抗体的生成。此外,白细胞介素4基因在机体中的的遗传变异可导致缺血性中风易感性提高,脑血管意外或脑梗塞等疾病。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中大鼠IL-4的浓度。大鼠IL-4捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的大鼠IL-4会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗大鼠IL-4抗体后,抗大鼠IL-4抗体与大鼠IL-4接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在IL-4将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,大鼠IL-4浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中IL-4浓度。

 

大鼠IL-4定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分

规格(96T/48T)

大鼠IL-4预包被板

12条/6条

样本分析缓冲液

5ml/3ml

标准品稀释液

10ml/5ml

大鼠IL-4标准品

4/2支(冻干)

大鼠IL-4生物素化抗体

10ml/5ml

亲和素连接的HRP酶

10ml/5ml

浓缩洗涤液 20×

30ml/15ml

TMB底物

10ml/5ml

中止液

5ml/3ml

封板胶纸

3/2张

说明书

1份

 

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作;

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;

B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集;

D.若待测样本不能及时检测,标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;

3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。

注:大鼠血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

 

注意事项:

1.试剂盒请保存在2~8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应,请严格控制在25~28℃。

9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长。

 

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25~28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-4终浓度达到1000pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置10~15分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为1000 pg/m l,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)

图片2.png 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300ul,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

 

实验过程需自备的材料:

1.不同规格的加样枪及相应的枪头;   

2.酶标仪;

3.自动洗板机;                    

4.去离子水或双蒸水;

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本,请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大,请将样本与样本分析缓冲液等量加入,不足部分用标准品稀释液补充至100ul。    

4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育60分钟。  

6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素链接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。

8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD1

典型OD2

OD平均值

0

0.0965

0.1293

0.1129

31.25

0.2873

0.2223

0.2548

62.5

0.3789

0.4019

0.3904

125

0.6921

0.6195

0.6558

250

1.0958

0.9952

1.0455

500

1.3597

1.5365

1.4481

1000

2.0691

1.9981

2.0336

大鼠IL-4参考标准曲线

图片1.png 

注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度,特异性和重复性:

1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为16pg/ml。

2.特异性:与GDNF,GM-CSF,IFN-γ,IL-1α,IL-1β,IL-2 ,IL-6,IL-10,PDGF-BB,TNF-α,human IL-4, mouse IL-4

等没有交叉反应。

3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.

 

参考文献:

1. Nelms, K. et al., (1999) Annu. Rev. Immunol. 17:701.

2. Erard, F. et.al., (1999) J. Immnol. 162:209.

3. Seder, R.A. et.al., (1998) J. Immunol. 160:5719.

4. Kelleher, P. et.al., (1999) Eur. J. Immunol. 29:2309.

5. Arinobu, Y. et.al., (1999) Cellular Immunology 191:161.

6. Fanslow, W.C. et al., (1990) Cytokine 2:3028.


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