大鼠细胞间粘附分子1定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测大鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的ICAM-1浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。

ICAM-1简介

细胞间粘附分子1(ICAM-1)是一个属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白。成熟的ICAM-1由27个氨基酸信号肽结构，466个氨基酸细胞外区域结构，25个氨基酸的跨膜区域结构，27个氨基酸的胞内区结构共545个氨基酸构成的分子。一般说来，ICAM-1在膜上以二聚体形式存在。溶解的ICAM-1有493个氨基酸残基，分子量为78kDa，因为是个糖蛋白，分子质量在110-125KDa之间。

ICAM-1在平滑肌细胞、角化细胞、内皮细胞、成纤维细胞、支气管内皮细胞、记忆性T细胞和B细胞、单核细胞、巨噬细胞等都有表达，ICAM-1的表达受炎性细胞因子的调控。

ICAM-1的基本功能是在受伤后或压力状态下，使得内皮细胞与白细胞粘附。ICAM-1能与白细胞功能抗原(LFA-1)或巨噬细胞1抗原(Mac-1)结合而起作用。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中大鼠ICAM-1的浓度。大鼠ICAM-1捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的大鼠ICAM-1会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗大鼠ICAM-1抗体后，抗大鼠ICAM-1抗体与大鼠ICAM-1接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在ICAM-1将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，大鼠ICAM-1浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中ICAM-1浓度。

大鼠ICAM-1定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：大鼠血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25～28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使ICAM终浓度达到4000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为4000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                    

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温(25～28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。    

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温(25～28℃)孵育60分钟。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素链接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温(25～28℃)孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温(25～28℃)孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

大鼠ICAM-1参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为14pg/ml。

2.特异性：与GDNF, GM-CSF,TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-2 ,IL-4 ,PDGF-BB, IL-10,人 ICAM,小鼠ICAM

等没有交叉反应。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Reilly, P.L. et al. (1995) J. Immunol. 155:529.

2. Jun, C-D. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:29019.

3. Miller, J. et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1231.

4. Stocker, C. et al. (2000) Transplantation 70:579.

5. Porter, J.C. et al. (2002) J. Immunol. 168:6330.

6. Chirathaworn, C. et al. (2002) J. Immunol. 168:5530.

7. Ballantyne, C. M.; Kozak, C. A.; O'Brien, W. E.; Beaudet, A. L. Assignment of the gene for intercellular adhesion molecule-1 (Icam-1) to proximal mouse chromosome 9. Genomics 9: 547-550, 1991.

8. Bella, J.; Kolatkar, P. R.; Marlor, C. W.; Greve, J. M.; Rossmann, M. G. The structure of the two aminoterminal domains of human ICAM-1 suggests how it functions as a rhinovirus receptor and as an LFA-1 integrin ligand. Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 4140-4145, 1998.

9. Simmons, D.; Makgoba, M. W.; Seed, B. ICAM, an adhesion ligand of LFA-1, is homologous to theneural cell adhesion molecule NCAM. Nature 331: 624-627, 1988.