人淋巴毒素α（TNF-β）定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的TNF-β浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有疑问请与安徽巧伊生物科技有限公司联系，我们将提供力所能及的帮助。 

TNF-β简介：

淋巴毒素α，也叫TNF-β，是一个属于肿瘤坏死家族的分泌蛋白。人的TNF-β是一个22 kDa的蛋白。分泌型的TNF-β是三倍体。当然，TNF-β也能与淋巴毒素β形成三倍体，从而将TNF-β锚定在细胞表面。TNF-β由活化的B淋巴细胞分泌，对自身免疫病的发生起重要作用。

TNF-β介导不同类型的炎症反应，免疫刺激以及抗病毒等过程。TNF-β除了对肿瘤细胞的细胞毒性外，TNF-β能刺激淋巴腺及淋巴结等淋巴器官的发育，参与淋巴器官的炎症及免疫功能。TNF-β也参与次级淋巴器官的形成和生长，同时TNF-β也参与细胞调亡。TNF-β的基因多态性也会诱导牛皮癣伴随着血清阴性的关节炎，即牛皮癣性关节炎。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中TNF-β 的浓度。TNF-β捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的TNF-β会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人TNF-β抗体后，抗人TNF-β抗体与TNF-β接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在TNF-β将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，TNF-β浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中TNF-β 浓度。

人TNF-β定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25-28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5x标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4 标准品: 根据标签复溶体积加入标准品稀释液使TNF-β终浓度达到2000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                    

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟。4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入HRP酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

人TNF-β参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为15.4pg/ml。

2.特异性：与人的GM-CSF，IL-8，IL-1β， TNF-α及小鼠的TNF-α等没有交叉反应。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献：

1. Chiang, E.Y. et al. (2009) Nat. Med. 15:766.

2. Warzocha, K. et al. (1995) Eur. Cytokine Netw. 6:83.

3. Seleznik, G.M. et al. (2014) Cytokine Growth Factor Rev. 25:125.

4. Kobayashi, Y. et al. (1986) J. Biochem. 100:727.

5. Mapara, M.Y. et al. (1994) Int. J. Cancer 58:248.

6. Drutskaya, M.S. et al. (2010) IUBMB Life 62:283.