人血管生成素定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的血管生成素浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组

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人血管生成素简介：

人血管生成素是一种非糖基化的多肽，有123个氨基酸残基组成，分子量为14 kDa，含有三个链内二硫键，属于核糖核酸酶家族。

血管生成素一般由血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、结肠柱状上皮细胞、淋巴细胞、腺癌干细胞以及肿瘤细胞系等细胞产生。血管生成素通常以分泌蛋白形式进入血液中，其含量高达60-120 ng / mL。

血管生成素作为核糖核酸酶与其它的核糖核酸酶家族成员一样，具有细胞毒性，其机理主要是抑制细胞中蛋白质的合成从而对细胞具有毒性。血管生成素也可以通过磷脂酶的活化，刺激毛细血管和脐静脉内皮细胞生成甘油二酯以及前列腺素的分泌。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中血管生成素的浓度。血管生成素捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的血管生成素会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人血管生成素抗体后，抗人血管生成素抗体与血管生成素接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在血管生成素将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，血管生成素浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中血管生成素浓度。

人血管生成素定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25-28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3. 将5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使血管生成素终浓度达到500pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为300 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请用1×标准品稀释液稀释至合适浓度检测，建议稀释100~8000倍。         

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。   

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

人Angiogenin参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为4.75pg/ml。

2.特异性：与EGF，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β，TGF-α，TGF-β1,小鼠 EGF，GM-CSF，MIP-1α等没有交叉反应。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Moroianu, J. and J.F. Riordan (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1677.

2. Moenner, M. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 226:483.

3. Bond, M.D. et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1162:177.

4. Beintema, J.J. (1989) FEBS Lett. 254:1.

5. Hu, G-F. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2227.

6. Russo, N. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2920.