人的C反应蛋白CRP定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的CRP浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。

CRP简介：

C反应蛋白（CRP）是人体内的急性反应蛋白，在人体免疫防御反应中重要的介导物，属于穿透素家族的蛋白。CRP蛋白的前体蛋白是224残基的蛋白，成熟的CRP有206个搭氨基酸残基，通过非共价结合的方式形成五聚体的环状结构。

无论是感染还是非感染性的炎症、组织坏死和恶性肿瘤时，人体血液中的CRP蛋白浓度都会急剧升高。在感染，炎症反应及组织坏死中，人血清中的CRP蛋白在24~48小时内可急剧升高到正常水平的1000倍。

在许多种细菌和真菌表面的胆碱磷酸是CRP蛋白的配体，CRP与配体的结合是依赖Ca2+的。CRP也可与受伤细胞的膜、坏死的胞核和调亡的细胞等结合。一旦与受体结合，CRP蛋白就会启动C1q，从而引起一系列的级联反应。CRP蛋白也会与吞噬细胞的表面Fcγ RI和Fcγ RII结合，从而启动吞噬细胞的吞噬反应。

CRP主要在肝内产生，IL-6是肝实质细胞产生CRP蛋白的主要介导物，此外IL-1和糖皮质激素也是CRP蛋白产生重要的诱导物。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中CRP的浓度。CRP捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的CRP会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入与HRP耦连的抗人CRP抗体后，抗人CRP抗体与CRP接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在CRP将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，CRP浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中CRP浓度。

人CRP定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，

D.标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用标准品稀释液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使CRP终浓度达到100ng/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为100ng/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育30分钟。如果是血清血浆样本，不同样本稀释比例不一样，一般范围在100~1000倍，如无明确范围，建议从200倍稀释，如果样本浓度过高，超过检测范围，请加大稀释倍数后重新稀释检测。

4.洗板3次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入HRP连接抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育30分钟。    

6.洗板3次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

8.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

人CRP参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为1.4ng/ml。

2.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Johnson HL et al; Applications of acute phase reactants in infectious diseases J.

Microbiol. Immunol. Infect. 1999, 32: 73

2. Helgeson N et al; C - Reactive Protein : Laboratory Medicine, Vol. 2 (Race G. J., Ed.),Harper & Row, Hagerstown, chapter 29 (1973).

3. Gewurz H et al; C-Reactive Protein and the Acute Phase Response. Adv in Int Med, 1982,27: 345

4. Frank, R. and R. Hargreaves (2003) Nat. Rev. Drug Disc. 2:566.