人正五聚蛋白-3 (Pentraxin 3)定量分析

酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的正五聚蛋白-3浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。

正五聚蛋白-3简介：

正五聚蛋白-3(PTX3)，也叫肿瘤坏死因子诱导蛋白5或肿瘤坏死因子刺激基因14(TSG-14)，属于正五聚超家族蛋白中的一员，人的正五聚蛋白-3是一个45kDa的糖蛋白。 巨噬细胞，中性粒细胞，骨髓来源的树突状细胞，卵巢粒细胞，内皮细胞，成纤维细胞，脂肪细胞，肾小球膜系细胞，滑液细胞，平滑肌细胞，泡状上皮细胞及神经胶质细胞等细胞均可产生正五聚蛋白-3。

正五聚蛋白-3是一个急性反应时相蛋白，人和小鼠在炎症和感染状态下，血清中的正五聚蛋白-3迅速上升。在动脉粥样硬化患者的血液中，正五聚蛋白-3会大量出现，在心肌梗死患者血液中，正五聚蛋白-3含量会明显升高。正五聚蛋白-3在免疫反应的调控中有双重调节作用，结合不能移动的正五聚蛋白-3通过C末端的正五聚蛋白结构域与补体组分C1q结合，触发经典的补体反应。另一方面，自由移动的正五聚蛋白-3抑制经典的补体反应。正五聚蛋白-3可能俱有像调理素类似的功能，通过与特定的病毒，真菌及细菌成分相互作用，保护机体免受感染。最后，正五聚蛋白-3可能在血管生成的过程中起重要作用，正五聚蛋白-3的N端能与碱性成纤维生长因子结合，从而抑制碱性成纤维生长因子依赖型的血管再生。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中PENTRAXIN 3 的浓度。PENTRAXIN 3 捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的PENTRAXIN 3 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人PENTRAXIN 3 抗体后，抗人PENTRAXIN 3 抗体与PENTRAXIN 3 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在PENTRAXIN 3 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，PENTRAXIN 3 浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中PENTRAXIN 3 浓度。

人PENTRAXIN 3定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3. 如有5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。

4.标准品:按标签复溶体积用标准品稀释液复溶使PENTRAXIN 3终浓度达到14ng/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为14 ng/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                    

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

人PENTRAXIN 3参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为84pg/ml。

2.特异性：与人的Pentraxin 2、CRP  无交叉反应性，与小鼠的Pentraxin 2、Pentraxin 3无交叉反应性。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Camozzi, M. et al. (2005) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25:1837.

2. Introna, M. et al. (1996) Blood 87:1862.

3. Baruah, P. et al. (2006) J. Leukoc. Biol. 80:87.

4. Garlanda, C. et al. (2002) Nature 420:182.

5. Jaillo n, S. et al. (2007) J. Exp. Med. 204:793.

6. Wisniewski, H. and J. Vilcek (2004) Cytokine Growth Factor Rev. 15:129.